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Ⅱ型膠原α1(COL2α1)人試劑盒 用于科研

Ⅱ型膠原α1(COL2α1)人試劑盒 用于科研

產(chǎn)品時間:2025-10-16

簡要描述:

Ⅱ型膠原α1(COL2α1)人試劑盒 用于科研是一個II型膠原蛋白的α-1鏈,II型膠原蛋白是一種纖維狀的膠原蛋白,存在于軟骨和眼睛的玻璃體中。該基因的突變與軟骨發(fā)育不全、早發(fā)性家族性骨關(guān)節(jié)炎、先天性SED、Langer-Saldino軟骨發(fā)育不全、Kniest發(fā)育不全、Stickler綜合征I型和Strudwick型脊柱骨骺線發(fā)育不全有關(guān)。

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Ⅱ型膠原α1(COL2α1)人試劑盒 用于科研
簡介  
ⅠⅡⅡ型膠原α1(COL2a1)是一個II型膠原蛋白的α-1鏈,II型膠原蛋白是一種纖維狀的膠原蛋白,存在于軟骨和眼睛的玻璃體中。該基因的突變與軟骨發(fā)育不全、早發(fā)性家族性骨關(guān)節(jié)炎、先天性SED、Langer-Saldino軟骨發(fā)育不全、Kniest發(fā)育不全、Stickler綜合征I型和Strudwick型脊柱骨骺線發(fā)育不全有關(guān)。此外,加工軟骨素的缺陷也與軟骨發(fā)育不良有關(guān),軟骨素是一種鈣結(jié)合蛋白,是這種膠原分子的C肽。II型膠原蛋白可增加結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度,主要存在于軟骨、填充眼球的果凍狀物質(zhì)(玻璃體)、內(nèi)耳以及脊柱中椎體之間的椎間盤中心部分(髓核)。三個pro-alpha1(II)鏈纏繞在一起,形成一個三股的、像繩索的procollagen分子。這些原膠原蛋白分子必須由細(xì)胞內(nèi)的酶來處理。

本試劑盒人COL2α1免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA,用于測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的人COL2α1。試劑盒包含大腸桿菌表達(dá)重組人COL2α1和針對重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然人COL2α1獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明,該試劑盒可用于測定天然人COL2α1的相對質(zhì)量值。

檢測原理

試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上,捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物COL2α1,孵育清洗后,再加入標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行孵育后清洗,形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物,隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育,待孵育結(jié)束后清洗,接著加入TMB顯色液后,若樣本中有待測物則顯藍(lán)色,則加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去,用酶標(biāo)儀在450nm處測OD值,顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中COL2α1的濃度。

操作要點

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時,應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染,在添加每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外,每種試劑應(yīng)單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果,在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當(dāng)使用自動洗板機(jī)時,在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期,或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度,可以提高測定精度。

4. 顯色劑應(yīng)保持無色,直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{(lán)色。

5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后,孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶標(biāo)儀,包含450nm測定波長,同時包含600-680nm校正波長更佳;

2. 移液器及槍頭;

3. 蒸餾水或去離子水;

4. 100-1000 mL刻度量筒;

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機(jī);

6. 水平軌道微孔板振蕩器,能夠保持500±50 rpm的速度;

7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。

Ⅱ型膠原α1(COL2α1)人試劑盒 用于科研

注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液,具有一定腐蝕性,應(yīng)謹(jǐn)慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑,可能會引起皮膚過敏反應(yīng),應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激,應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品,處理后洗手。

試劑準(zhǔn)備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置:如果洗滌液/稀釋液(20×)有晶體析出,需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋(例如:1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水)

標(biāo)準(zhǔn)品配置

試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品,準(zhǔn)備7個試管,先從200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品(200μL)按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至10ng/mL(例:50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液,制備得到1000μL的10ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品),隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液,在這6個單獨的試管中將10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個梯度,共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,依次為: 10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0.156ng/mL,從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中,輕輕吹打混勻,以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋(如圖所示),1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)

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結(jié)果的計算

計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯(4-P)曲線擬合的計算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0.156

0

OD

2.619

1.898

1.004

0.689

0.49

0.263

0.193

0.07

校正OD

2.549

1.828

0.934

0.619

0.42

0.193

0.123

0

Ⅱ型膠原α1(COL2α1)人試劑盒 用于科研

本圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例,結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計算樣本結(jié)果
靈敏度

經(jīng)樣本測試,本試劑盒的檢測靈敏度為為0.08ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別天然和重組人COL2α1。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL,并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。

實驗步驟匯總 
1. 加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品,37℃避光反應(yīng)1.5h,洗滌3次。

2. 加檢測抗體,37℃避光反應(yīng)1h,洗滌4次。

3. 加酶結(jié)合物,37℃避光反應(yīng)30分鐘,洗滌4次。

4. 加顯色液,37℃避光反應(yīng)15分鐘。

5. 加終止液,在5分鐘內(nèi)讀數(shù)

Ⅱ型膠原α1ELISA試劑盒用于定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中人的COL2α1,使用本產(chǎn)品之前,必須完整閱讀本說明書,人ELISA試劑盒僅供科研使用,不能于其它診斷

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